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云南紅豆杉（TaxusyunnanensisChengetLu）別稱紫杉、赤柏松，屬紅豆杉科喬木，產(chǎn)于云南西北部及西部、四川西南部與西藏東部，是生產(chǎn)紫杉醇的主要樹種[1-3]。云南紅豆杉是集用材、藥用、綠化于一體的珍貴樹種，特別是其紫杉醇含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他紅豆杉樹種[4]。紫杉醇具有抗癌活性，云南紅豆杉的野生資源比較少，人工培育紅豆杉是目前獲取紫杉醇最可行、有效的途徑[1，5]。為了更好地保護(hù)野生云南紅豆杉野生資源，大力培育后續(xù)產(chǎn)業(yè)，以滿足市場對云南紅豆杉資源的需求，近年來在云南麗江、大理、楚雄和丘北等地建立了云南紅豆杉人工種植林。由于云南紅豆杉的廣泛栽培，病害發(fā)生嚴(yán)重，尤其是云南紅豆杉葉片葉斑病現(xiàn)象日趨普遍，影響了樹勢生長及藥用、觀賞價(jià)值。分離與鑒定病原菌是開展云南紅豆杉抗病防治研究的基礎(chǔ)。本試驗(yàn)從自然感病的云南紅豆杉上分離純化得到1株對云南紅豆杉具有寄生作用的真菌，利用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)觀察與現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合的方法，對云南紅豆杉葉斑病病原菌進(jìn)行了鑒定，并依據(jù)其形態(tài)特點(diǎn)與培養(yǎng)性狀進(jìn)行了初步研究，為云南紅豆杉葉斑病的防治奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也為進(jìn)一步了解該病害的發(fā)病規(guī)律提供了一定的理論依據(jù)。
1材料與方法
1.1病原菌的分離
云南紅豆杉葉斑病葉片采自云南省楚雄市西山，用組織分離法分離病原菌，經(jīng)科赫氏法鑒定其為云南紅豆杉葉斑病的病原，菌株編號為hongdoushan02。
1.2病原菌的鑒定
1.2.1形態(tài)學(xué)鑒定利用顯微鏡觀察純化分離到的病原菌，并對其進(jìn)行形態(tài)鑒定。
1.2.2病原菌rDNA-ITS序列擴(kuò)增和分析用CTAB法提取病原菌全基因組DNA，進(jìn)行ITS-PCR擴(kuò)增。引物序列為ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′；ITS5：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′。PCR反應(yīng)體系總體積25μL，反應(yīng)各成分終濃度為：Taq酶0.02U/μL、引物0.4μmol/L、DNA模板20ng/μL、dNTPs0.4μmol/L、2×PCR反應(yīng)緩沖液。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，52℃退火45s，72℃復(fù)性45s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物送北京百泰克生物技術(shù)有限公司測序，所得序列在NCBI上比對，下載與其相似性較高的序列及其近似屬的序列，用BioEdit、ClustalX和MEGA4.1軟件采用NJ法進(jìn)行系統(tǒng)分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。
1.3生物學(xué)特性研究[6-7]
1.3.1不同碳源和氮源對菌落生長的影響
以察氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別以葡萄糖、甘油、D-果糖、D-半乳糖、乳糖、可溶性淀粉等量取代其碳源；分別以硫酸銨、硝酸銨、甘氨酸、L-苯丙氨酸、牛肉膏、蛋白胨取代氮源。每種培養(yǎng)基中分別接種直徑為5mm的菌塊，25℃恒溫黑暗培養(yǎng)，5d后用“十”字交叉法測量菌落直徑。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。
1.3.2不同溫度對菌落和分生孢子萌發(fā)的影響
取直徑為5mm的菌塊接種于察氏培養(yǎng)基中央，分別在5、10、15、20、25、28、30、32、35、40、45℃黑暗下恒溫培養(yǎng)，5d后測量菌落直徑。用無菌水制備菌懸液，滴于載玻片上，培養(yǎng)條件同菌落培養(yǎng)，24h后鏡檢孢子萌發(fā)率，每次檢100個(gè)孢子。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。
1.3.3不同pH值對菌落和分生孢子萌發(fā)的影響
將高壓滅菌后的察氏培養(yǎng)基pH值分別調(diào)為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、10.9倒平板，取直徑5mm的菌塊接種于察氏培養(yǎng)基中央，黑暗條件下25℃培養(yǎng)5d后測量菌落直徑。用0.2mol/L磷酸氫二鈉和0.2mol/L檸檬酸緩沖液將分生孢子懸浮液pH值調(diào)配為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、10.9，置于25℃恒溫箱黑暗培養(yǎng)，24h后鏡檢萌發(fā)率，每次檢100個(gè)孢子。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。
1.3.4不同光照處理
取直徑為5mm的菌塊接種于察氏培養(yǎng)基中央，分別置于24h光照、12h/12h光暗交替、24h黑暗環(huán)境中，25℃培養(yǎng)5d后測量菌落直徑。用無菌水制備菌懸液，滴于載玻片上，培養(yǎng)條件同菌落培養(yǎng)，24h后鏡檢孢子萌發(fā)率，每次鏡檢100個(gè)孢子。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。
1.4不同殺菌劑對菌落生長的影響
將代森錳鋅、百菌清、敵克松、霜·錳鋅和撲海因用無菌水按其常用倍數(shù)稀釋，每10mL培養(yǎng)基中加入1mL藥液制成含藥液的平板，對照組加入等量無菌水。取5mm菌塊置于察氏培養(yǎng)基平板中央，25℃黑暗培養(yǎng)5d后測量菌落直徑。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。
2結(jié)果與分析
2.1云南紅豆杉病原菌的鑒定
2.1.1形態(tài)學(xué)鑒定
該病主要發(fā)生在葉部，發(fā)病初期葉片中部出現(xiàn)多個(gè)黃褐色病斑，病斑邊緣黑色，隨著病情的發(fā)展，可延伸至整個(gè)葉片，使葉片枯萎死亡。在PDA培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)6d菌落直徑達(dá)4cm，菌落青灰色相間，圓形、規(guī)則，邊緣整齊，菌絲絮狀，培養(yǎng)一段時(shí)間后可看到培養(yǎng)皿蓋上有水珠；背面輪紋狀，中心圓褐色，外圍一環(huán)黃色；菌落生長緩慢（圖1）。菌絲有隔，淡褐色，產(chǎn)孢細(xì)胞孔生式產(chǎn)孢，合軸式延伸或有時(shí)不再延伸；分生孢子多串生（向頂系列），有的單生，卵形或倒棍棒形，具喙，淡橄欖褐至橄欖褐色或褐色，光滑，具橫隔膜及縱向隔膜，大小（2.4～6.2）μm×（2.9～7.1）μm（平均2.65μm×6.65μm）。分生孢子頂端或喙部，�？咨疆a(chǎn)生新的分生孢子，如此聯(lián)系產(chǎn)生，形成分枝或不分枝的孢子鏈（圖2、圖3）。
1材料與方法
1.1病原菌的分離
云南紅豆杉葉斑病葉片采自云南省楚雄市西山，用組織分離法分離病原菌，經(jīng)科赫氏法鑒定其為云南紅豆杉葉斑病的病原，菌株編號為hongdoushan02。
1.2病原菌的鑒定
1.2.1形態(tài)學(xué)鑒定利用顯微鏡觀察純化分離到的病原菌，并對其進(jìn)行形態(tài)鑒定。
1.2.2病原菌rDNA-ITS序列擴(kuò)增和分析用CTAB法提取病原菌全基因組DNA，進(jìn)行ITS-PCR擴(kuò)增。引物序列為ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′；ITS5：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′。PCR反應(yīng)體系總體積25μL，反應(yīng)各成分終濃度為：Taq酶0.02U/μL、引物0.4μmol/L、DNA模板20ng/μL、dNTPs0.4μmol/L、2×PCR反應(yīng)緩沖液。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，52℃退火45s，72℃復(fù)性45s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物送北京百泰克生物技術(shù)有限公司測序，所得序列在NCBI上比對，下載與其相似性較高的序列及其近似屬的序列，用BioEdit、ClustalX和MEGA4.1軟件采用NJ法進(jìn)行系統(tǒng)分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。
1.3生物學(xué)特性研究[6-7]
1.3.1不同碳源和氮源對菌落生長的影響
以察氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別以葡萄糖、甘油、D-果糖、D-半乳糖、乳糖、可溶性淀粉等量取代其碳源；分別以硫酸銨、硝酸銨、甘氨酸、L-苯丙氨酸、牛肉膏、蛋白胨取代氮源。每種培養(yǎng)基中分別接種直徑為5mm的菌塊，25℃恒溫黑暗培養(yǎng)，5d后用“十”字交叉法測量菌落直徑。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。
1.3.2不同溫度對菌落和分生孢子萌發(fā)的影響
取直徑為5mm的菌塊接種于察氏培養(yǎng)基中央，分別在5、10、15、20、25、28、30、32、35、40、45℃黑暗下恒溫培養(yǎng)，5d后測量菌落直徑。用無菌水制備菌懸液，滴于載玻片上，培養(yǎng)條件同菌落培養(yǎng)，24h后鏡檢孢子萌發(fā)率，每次檢100個(gè)孢子。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。
1.3.3不同pH值對菌落和分生孢子萌發(fā)的影響
將高壓滅菌后的察氏培養(yǎng)基pH值分別調(diào)為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、10.9倒平板，取直徑5mm的菌塊接種于察氏培養(yǎng)基中央，黑暗條件下25℃培養(yǎng)5d后測量菌落直徑。用0.2mol/L磷酸氫二鈉和0.2mol/L檸檬酸緩沖液將分生孢子懸浮液pH值調(diào)配為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、10.9，置于25℃恒溫箱黑暗培養(yǎng)，24h后鏡檢萌發(fā)率，每次檢100個(gè)孢子。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。
1.3.4不同光照處理
取直徑為5mm的菌塊接種于察氏培養(yǎng)基中央，分別置于24h光照、12h/12h光暗交替、24h黑暗環(huán)境中，25℃培養(yǎng)5d后測量菌落直徑。用無菌水制備菌懸液，滴于載玻片上，培養(yǎng)條件同菌落培養(yǎng)，24h后鏡檢孢子萌發(fā)率，每次鏡檢100個(gè)孢子。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。
1.4不同殺菌劑對菌落生長的影響
將代森錳鋅、百菌清、敵克松、霜·錳鋅和撲海因用無菌水按其常用倍數(shù)稀釋，每10mL培養(yǎng)基中加入1mL藥液制成含藥液的平板，對照組加入等量無菌水。取5mm菌塊置于察氏培養(yǎng)基平板中央，25℃黑暗培養(yǎng)5d后測量菌落直徑。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。
2結(jié)果與分析
2.1云南紅豆杉病原菌的鑒定
2.1.1形態(tài)學(xué)鑒定
該病主要發(fā)生在葉部，發(fā)病初期葉片中部出現(xiàn)多個(gè)黃褐色病斑，病斑邊緣黑色，隨著病情的發(fā)展，可延伸至整個(gè)葉片，使葉片枯萎死亡。在PDA培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)6d菌落直徑達(dá)4cm，菌落青灰色相間，圓形、規(guī)則，邊緣整齊，菌絲絮狀，培養(yǎng)一段時(shí)間后可看到培養(yǎng)皿蓋上有水珠；背面輪紋狀，中心圓褐色，外圍一環(huán)黃色；菌落生長緩慢（圖1）。菌絲有隔，淡褐色，產(chǎn)孢細(xì)胞孔生式產(chǎn)孢，合軸式延伸或有時(shí)不再延伸；分生孢子多串生（向頂系列），有的單生，卵形或倒棍棒形，具喙，淡橄欖褐至橄欖褐色或褐色，光滑，具橫隔膜及縱向隔膜，大小（2.4～6.2）μm×（2.9～7.1）μm（平均2.65μm×6.65μm）。分生孢子頂端或喙部，�？咨疆a(chǎn)生新的分生孢子，如此聯(lián)系產(chǎn)生，形成分枝或不分枝的孢子鏈（圖2、圖3）。
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